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Jun 20, 2023

Le particelle magnetiche di idrogel migliorano il sequenziamento dei nanopori della SARS

Scientific Reports volume 13,

Rapporti scientifici volume 13, numero articolo: 2163 (2023) Citare questo articolo

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Qui viene presentato un flusso di lavoro abilitato alle particelle di idrogel magnetico per l'acquisizione e la concentrazione di SARS-CoV-2 da campioni di tamponi residui diagnostici che migliora significativamente i risultati di sequenziamento utilizzando la piattaforma di sequenziamento MinION di Oxford Nanopore Technologies. Il nostro approccio utilizza una nuova particella di idrogel magnetico basata sull'affinità, aggirando i bassi volumi di campione in ingresso e consentendo flussi di lavoro rapidi manuali e automatizzati ad alta produttività compatibili con il sequenziamento di Nanopore. Questo approccio migliora i protocolli standard di estrazione dell'RNA, fornendo miglioramenti fino a 40 volte nelle letture mappate virali e migliora la copertura del sequenziamento del 20-80% da campioni residui diagnostici a titolo inferiore. Inoltre, dimostriamo che questo approccio funziona per campioni di virus influenzali e virus respiratori sinciziali artificiali, suggerendo che può essere utilizzato per identificare e migliorare i risultati di sequenziamento di più virus nei campioni VTM. Questi metodi possono essere eseguiti manualmente o su una piattaforma di automazione KingFisher.

Al 10 aprile 2022, si sono verificati più di 500 milioni di casi di COVID-19 e quasi 6,2 milioni di decessi correlati a COVID-19 in tutto il mondo1. Le mutazioni virali hanno permesso alla pandemia di pervadere la vita di tutti i giorni nonostante l’uso di misure sanitarie globali diffuse per prevenire la diffusione di SARS-CoV-2. Il rilevamento e il monitoraggio delle varianti virali emergenti sono diventati strumenti fondamentali nella risposta sanitaria globale, evidenziando la necessità di metodi di sequenziamento accurati e rapidamente implementabili2,3,4,5. I recenti progressi nelle tecnologie di sequenziamento di nuova generazione (NGS) hanno reso più possibile l’uso di routine del sequenziamento per il monitoraggio e l’identificazione di epidemie virali, ma molti strumenti NGS non sono portatili e hanno ancora costi proibitivi, limitandone così l’adozione complessiva6,7. La piattaforma MinION di Oxford Nanopore Technologies (ONT) offre una strategia di rilevamento relativamente economica e portatile, in grado di identificare e sequenziare vari virus respiratori sul campo8,9,10.

Sebbene i progressi nel sequenziamento rendano possibile il rilevamento e la caratterizzazione rapidi in loco del SARS-CoV-2 e di altri genomi virali, questi sequenziatori portatili sono ancora limitati da alcuni svantaggi, vale a dire che, a meno che non vengano utilizzate grandi quantità di RNA virale per le reazioni di sequenziamento, non è possibile possono esserci problemi di precisione durante l'identificazione delle basi11,12,13,14,15,16. Queste limitazioni tecniche riducono l’utilità di uno strumento che potrebbe migliorare la capacità di rispondere in modo rapido e accurato alle epidemie virali e di tracciare la trasmissione in tempo reale.

Aumentare la quantità totale di materiale di RNA per l'analisi attraverso l'arricchimento del campione è una strategia disponibile per migliorare le prestazioni delle piattaforme di sequenziamento. A tal fine, abbiamo cercato di affrontare le limitazioni del sequenziamento virale di un sequenziatore di nanopori applicando la tecnologia di arricchimento delle particelle di idrogel magnetico basata sull’affinità (particelle Nanotrap) ai campioni di mezzo di trasporto virale (VTM) SARS-CoV-2. In breve, le particelle di idrogel magnetico migliorano le prestazioni del test facilitando il legame rapido dell'analita (ad es. virioni intatti) da grandi volumi di campione e riducendo la presenza di sostanze interferenti nei test a valle. Le particelle di idrogel catturano e concentrano gli analiti di interesse utilizzando piccole molecole, come coloranti di affinità, che sono immobilizzate su una struttura di catene polimeriche reticolate. Queste piccole molecole si legano ai loro bersagli (ad esempio le proteine ​​di superficie dei virioni), spesso con un'affinità molto elevata, attraverso una combinazione di interazioni elettrostatiche e idrofiche. Una volta legati alla particella magnetica dell'idrogel, i virioni possono essere concentrati e rimossi dalla matrice del campione utilizzando una semplice fase di separazione magnetica. Dopo la concentrazione, i virioni sono strettamente legati al colorante di affinità delle particelle di idrogel e gli acidi nucleici virali non sono disponibili per l'analisi molecolare. Pertanto, viene utilizzato un kit di estrazione dell'acido nucleico per lisare i virioni e purificare gli acidi nucleici virali in preparazione per un'analisi molecolare a valle. La tecnologia delle particelle Nanotrap ha mostrato un'ampia applicazione nella diagnostica clinica arricchendo e stabilizzando biomarcatori e analiti in campioni clinici complessi. Studi recenti hanno dimostrato questo processo di concentrazione ed estrazione, dimostrando che le particelle di idrogel magnetico sono in grado di concentrare e migliorare il rilevamento di molti tipi virali, incluso SARS-CoV-2, su molteplici test molecolari17,18,19,20,21.